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細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)效率低如何破?
發(fā)布時間： 2021-11-25 點(diǎn)擊次數(shù)： 2600次細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低如何破?
細(xì)胞轉(zhuǎn)染是細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的一種常用的技術(shù)手段。而轉(zhuǎn)染效率低卻是實(shí)驗(yàn)科研者經(jīng)常遇到的問題，尤其是原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染，更是因?yàn)殡y度大，號稱誰碰誰死，而令人談虎色變。不，應(yīng)該是談原代細(xì)胞色變。
當(dāng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到轉(zhuǎn)染這一步時有哪些坑要避免?需要注意的因素有哪些呢?
1.細(xì)胞系的選擇：
細(xì)胞系選擇有時是實(shí)驗(yàn)的需要，有時是實(shí)驗(yàn)室條件的限制。如果有選擇的余地當(dāng)然挑個容易做的。越是接近體內(nèi)的真實(shí)情況的原代細(xì)胞，通常越是難于伺候。反之亦然。此外細(xì)胞本身的特性也是需要考慮的因素。有時需要根據(jù)細(xì)胞系來選擇合適的轉(zhuǎn)染方法;而有時一些啟動子在不同的細(xì)胞系中表現(xiàn)的功能也不同。這些都是設(shè)計實(shí)驗(yàn)時需要考慮的因素，姑且不論。不過因?yàn)槭芟抻谔囟ǖ募?xì)胞，如何選擇合適的轉(zhuǎn)染方法就值得考究了。因?yàn)椴煌募?xì)胞可能適用不同的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染條件。如果實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立了全套方法，照做可也。如果是個新來的細(xì)胞株，最好查查資料看哪些成功轉(zhuǎn)染案例。
2. 預(yù)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備充足
我們做轉(zhuǎn)染的時候，在開展正式實(shí)驗(yàn)前要多做預(yù)試驗(yàn)，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件包括：試劑的用量、DNA密度、細(xì)胞密度、脂質(zhì)體和DNA混合孵育時間等等。
3.電轉(zhuǎn)染電壓控制
做電轉(zhuǎn)的時候，如果電壓太大，往往會發(fā)生細(xì)胞大量死亡的情況。不同的細(xì)胞，需要的電壓是不一樣的。這就要求我們多做預(yù)實(shí)驗(yàn)，多摸索條件。對于大多數(shù)細(xì)胞來說，其最佳電壓位于250-1250v/cm。另外，就是進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞應(yīng)該處于對數(shù)生長期。處于對數(shù)生長期的細(xì)胞的抗損傷能力是*的。細(xì)胞濃度應(yīng)該處于5x106到1x107/mL之間。每次轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒應(yīng)該控制在4-6 μg，如果﹥10μg，轉(zhuǎn)染效率也大大降低。電擊后，應(yīng)該將DNA和細(xì)胞混合液在室溫下放置10分鐘，使細(xì)胞恢復(fù)損傷。
4.試劑品質(zhì)選擇
有時候轉(zhuǎn)染效率低下，還要考慮會不會存在試劑過期的情況。有老師當(dāng)時做轉(zhuǎn)染整整半年，百思不得其解。最后發(fā)現(xiàn)，原來是轉(zhuǎn)染試劑過期了。換了之后，立馬成功。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，盡量使用開封半年內(nèi)的，因?yàn)檫^了半年后，就算沒有過失效期，但是細(xì)胞毒性大大增加，而轉(zhuǎn)染效率卻大大下降。千萬不要為了省錢，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)度哈。而現(xiàn)在，出了第三代多肽小分子材料的轉(zhuǎn)染試劑，對細(xì)胞毒性低，適用細(xì)胞廣，轉(zhuǎn)染效率高，這邊十分推薦ZETA LIFE品牌的Advanced系列DNA、RNA的轉(zhuǎn)染試劑，合適目錄大多數(shù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
5.血清培養(yǎng)很重要
轉(zhuǎn)染后未及時加入血清，會導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡。如果用的是Lipo系列的脂質(zhì)體材料轉(zhuǎn)染試劑一般要在轉(zhuǎn)染后的4-6小時換液且換為有血清的培養(yǎng)基。如果是Advanced系列DNA、RNA的轉(zhuǎn)染試劑則為轉(zhuǎn)染24小時后進(jìn)行正常換液，不能像Lipo系列轉(zhuǎn)染試劑一樣在4-6小時后換液。其實(shí)也可以在原來的無血清培養(yǎng)基里面滴加血清。這個時候，最好不要換液，不要打擾細(xì)胞，讓它安安靜靜地休息。但是也不能過早加入血清。過早的話，會引起未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞快速生長。那么，什么是最佳時機(jī)呢?在20%的細(xì)胞變圓的時候，就是加血清的最佳時機(jī)。不過要特別注意：對于RNA轉(zhuǎn)染，如何消除血清中潛在的RNase污染是值得關(guān)注的。所以血清的質(zhì)量也是需要關(guān)注的，一般建議使用超低內(nèi)毒素胎牛血清。新加培養(yǎng)基的預(yù)熱對細(xì)胞轉(zhuǎn)染很有幫助。
6. 防止細(xì)胞污染
細(xì)胞污染也是造成細(xì)胞死亡，轉(zhuǎn)染效率低下的一大原因。首先，轉(zhuǎn)染細(xì)胞用的質(zhì)粒必須保證無菌。而現(xiàn)在市場上的一般的質(zhì)粒提取試劑盒都做不到絕對無菌。業(yè)內(nèi)有個一個獨(dú)門絕招：將提完質(zhì)粒后或者提的最后一步，用75%乙醇沉淀，這樣就除菌了。
7.質(zhì)粒數(shù)量保證
轉(zhuǎn)染用的質(zhì)粒首先要保證數(shù)量，一般為2 μg以上。質(zhì)粒純度不夠或者含有細(xì)菌LPS或其他對細(xì)胞有毒害作用的物質(zhì)，也會影響轉(zhuǎn)染效率。這個時候，就應(yīng)該對質(zhì)粒進(jìn)行純化和濃縮。
8.注意細(xì)節(jié)
在轉(zhuǎn)染之前更換一次37℃預(yù)溫的培養(yǎng)基，可提高轉(zhuǎn)染效率。脂質(zhì)體和DNA/RNA混合物應(yīng)當(dāng)一滴一滴地滴下來，從培養(yǎng)皿一邊滴到另一邊，邊滴邊輕搖培養(yǎng)皿，以確保均勻分布和避免局部高濃度。這些都是一些細(xì)枝末節(jié)，但是如果不注意的話，也會造成轉(zhuǎn)染效率低下。
9.細(xì)胞狀態(tài)良好
轉(zhuǎn)染前細(xì)胞最好經(jīng)過1—2次傳代，以保證細(xì)胞生長旺盛，容易轉(zhuǎn)染。注意，貼壁細(xì)胞生長到幾乎滿片時就要趕快進(jìn)行下一次傳代，千萬不要使細(xì)胞保持融合超過24小時，因?yàn)橐坏╅L滿了，細(xì)胞們就“故步自封"不思轉(zhuǎn)染啦?；盍Τ渑娴哪贻p細(xì)胞更容易接受外來的新鮮事物嘛。
大多數(shù)已建立的細(xì)胞系都是非整倍體，細(xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化，這會導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。如果隨時間發(fā)現(xiàn)這種變化，融化一管新鮮的細(xì)胞可能會恢復(fù)原先的轉(zhuǎn)染活性。比如，新鮮融化的NIH 3T3細(xì)胞比傳代8次的細(xì)胞表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)染效率(融化細(xì)胞的進(jìn)一步傳代不會馬上降低轉(zhuǎn)染效率)。因此，如果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)最佳結(jié)果。
10. 恰到好處的鋪板密度：
轉(zhuǎn)染時的細(xì)胞密度對轉(zhuǎn)染效率影響非常顯著。不同的轉(zhuǎn)染試劑，要求轉(zhuǎn)染時的最適細(xì)胞密度各不相同，即使同一種試劑，也會因不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。轉(zhuǎn)染時過高或者過低的細(xì)胞密度會導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低，乃至表達(dá)水平偏低。因此如果選用新的細(xì)胞系或者新的轉(zhuǎn)染試劑，最好能夠進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)并為以后的實(shí)驗(yàn)建立一個穩(wěn)定方法，包括適當(dāng)?shù)慕臃N量和培養(yǎng)時間等等。一般轉(zhuǎn)染時貼壁細(xì)胞密度為40%-80%，但這個需要參考所選轉(zhuǎn)染試劑的說明書——陽離子脂質(zhì)體具有微量的細(xì)胞毒性而往往需要更高的鋪板密度或者更多的懸浮細(xì)胞數(shù)，有的要求細(xì)胞90%匯片;而有些多胺或者非脂質(zhì)體的配方則要求在40%—80%之間，總之是盡量在細(xì)胞最適的生理狀態(tài)下轉(zhuǎn)染，以求最佳的轉(zhuǎn)染效果。
不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊矔绊戅D(zhuǎn)染時的鋪板密度，比如研究細(xì)胞周期相關(guān)基因等表達(dá)周期長的基因，就需要較低的鋪板密度，所以需要選擇能夠在較低鋪板密度下進(jìn)行轉(zhuǎn)染的試劑需要特別注意。
11. 溫暖舒適的培養(yǎng)基
健康的細(xì)胞培養(yǎng)是一切成功轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)。不同的細(xì)胞類型有不同的特性，需要特定的培養(yǎng)基、血清、補(bǔ)充添加劑等等。
12.抗生素的控制
支原體、細(xì)菌、真菌污染，無論對于細(xì)胞培養(yǎng)或者轉(zhuǎn)染都是“不堪回首的痛"，可能會嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)染結(jié)果，細(xì)胞培養(yǎng)過程中往往會添加抗生素來防止污染。但是這些添加劑可能對轉(zhuǎn)染造成麻煩。比如青霉素和鏈霉素，就是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對于真核細(xì)胞無毒，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性，使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。這可能間接導(dǎo)致細(xì)胞死亡，造成轉(zhuǎn)染效率低。所以整個過程都不要用抗生素。
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