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細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法

發(fā)布時(shí)間： 2021-11-25　　點(diǎn)擊次數(shù)： 3790次

細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法

細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子如DNA，RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究和控制真核細(xì)胞基因功能的常規(guī)工具。在研究基因功能、調(diào)控基因表達(dá)、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學(xué)試驗(yàn)中，其應(yīng)用越來(lái)越廣泛。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的種類(lèi)主要是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，目的和區(qū)別如下所示：
隨著基因與蛋白功能研究的深入，轉(zhuǎn)染目前已成為實(shí)驗(yàn)室工作中經(jīng)常涉及的基本方法。轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)三類(lèi)途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬于通過(guò)物理方法將基因?qū)爰?xì)胞的范例；化學(xué)介導(dǎo)方法很多，如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法和多種陽(yáng)離子物質(zhì)介導(dǎo)的技術(shù)；生物介導(dǎo)方法，有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染和現(xiàn)在比較多見(jiàn)的各種病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)。如下圖所示：

下面分別介紹下原理和應(yīng)用特點(diǎn)：

化學(xué)轉(zhuǎn)染法

1. DEAE－葡聚糖法

原理：帶正電的DEAE-葡聚糖與核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞。
主要應(yīng)用：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
特點(diǎn)：相對(duì)簡(jiǎn)便、重復(fù)比磷酸鈣好，但對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用，轉(zhuǎn)染時(shí)需除去血清。聚合物濃度、核酸或蛋白質(zhì)與聚合物的比值，以及轉(zhuǎn)染的持續(xù)時(shí)間是重要的優(yōu)化參數(shù)，另外，此方法對(duì)附著細(xì)胞的轉(zhuǎn)染非常有效，也可用于某些懸浮細(xì)胞系。（詳細(xì)信息可參考文獻(xiàn)：Gulick T .Transfection using DEAE-dextran. Curr Protoc Cell Biol. 2003 Aug;Chapter 20:Unit 20.4. doi: 10.1002/0471143030.cb2004s19.）。

2. 磷酸鈣共沉淀法

原理：DNA與濃縮的氯化鈣溶液混合，然后添加到含有磷酸鹽離子的緩沖液中，形成磷酸鈣-DNA沉淀物，磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞。
主要應(yīng)用：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，染瞬轉(zhuǎn)染
特點(diǎn)：不適用于原代細(xì)胞（所需的DNA濃度較高），操作簡(jiǎn)便但重復(fù)性差，有些細(xì)胞不適用細(xì)胞建議用CSCL梯度離心，轉(zhuǎn)染時(shí)拷貝數(shù)較多。

3. 陽(yáng)離子脂質(zhì)體法

原理：帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物，然后脂質(zhì)體上剩余的電核與細(xì)胞膜上的唾液酸殘基的負(fù)電核結(jié)合；另一種解釋是通過(guò)細(xì)胞是內(nèi)吞作用而被進(jìn)入細(xì)胞。(若DNA濃度過(guò)高，中和脂質(zhì)體表面電核，而降低了與細(xì)胞的結(jié)合能力)。
主要應(yīng)用：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，所有細(xì)胞
特點(diǎn)：使用方法簡(jiǎn)單，可攜帶大片段DNA，通用于各種類(lèi)型的裸露DNA或RNA，能轉(zhuǎn)染各種類(lèi)型的細(xì)胞，沒(méi)有免疫原性。雖在體外基因轉(zhuǎn)染中有很高的效率，但在體內(nèi)，能被血清清除，并在肺組織內(nèi)累積，誘發(fā)強(qiáng)烈的抗炎反應(yīng)，導(dǎo)致高水平的毒性，這在很大程度上限制了其應(yīng)用。（生工產(chǎn)品編號(hào)E607403 LipoHigh 脂質(zhì)體高效轉(zhuǎn)染試劑）。結(jié)果如下圖所示：

pEGFP-N1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Hela 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前一天將 Hela 細(xì)胞接種于 24 孔板中，1E+5 個(gè)細(xì)胞/孔；轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞培養(yǎng)基換成無(wú)血清培養(yǎng)基，按 LipoHigh (µl)：DNA (µg)= 3：1 進(jìn)行轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染 4 小時(shí)后更換培養(yǎng)基為含有血清的新鮮培養(yǎng)基， 24 小時(shí)后，奧林巴斯 IX73 熒光倒置顯微鏡下觀察結(jié)果。

4. 陽(yáng)離子聚合物

原理：帶正電的聚合物與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成帶正電的復(fù)合物后與細(xì)胞表面帶負(fù)電的蛋白多糖相互作用，并通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。
應(yīng)用范圍：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，所有細(xì)胞
特點(diǎn)：除了具有陽(yáng)離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率高，操作簡(jiǎn)單，適用范圍廣，重復(fù)性好等特點(diǎn)外，還具有在體內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率高，細(xì)胞毒性低等特點(diǎn)，是新一代的轉(zhuǎn)染試劑。（生工產(chǎn)品是E607401 PolyHigh 非脂質(zhì)體高效轉(zhuǎn)染試劑）。結(jié)果如下圖所示：
pEGFP-N1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HepG2 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前一天將 HepG2 細(xì)胞接種于 24 孔板中，1E+5 個(gè)細(xì)胞/孔；轉(zhuǎn)染更換新鮮培養(yǎng)基，按 PloyHigh (µL)：DNA (µg)= 2：1 進(jìn)行轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染 4 小時(shí)后更換培養(yǎng)基，24 小時(shí)后，奧林巴斯 IX73 熒光倒置顯微鏡下觀察。

病毒轉(zhuǎn)染法

1.逆轉(zhuǎn)錄病毒

原理：通過(guò)病毒中膜糖蛋白和宿主細(xì)胞表面的受體相互作用而進(jìn)入宿主細(xì)胞，之后反轉(zhuǎn)入酶啟動(dòng)合成DNA并隨機(jī)整合到宿主基因組中。
主要應(yīng)用：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，特定宿主細(xì)胞
特點(diǎn)：可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、原代細(xì)胞，體內(nèi)細(xì)胞等，但攜帶基因不能太大（<8kb），要求細(xì)胞要處于分裂期，需考慮安全因素。如下圖所示：
逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)：逆轉(zhuǎn)錄病毒將自身基因組及其攜帶的外源基因隨機(jī)、穩(wěn)定地整合入宿主細(xì)胞基因組中，可實(shí)現(xiàn)目的基因穩(wěn)定、長(zhǎng)期的表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)根據(jù)不同的包裝細(xì)胞系可分為單嗜性、雙嗜性和泛嗜性，不同包裝細(xì)胞產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒能夠特異性地感染某一個(gè)或某一類(lèi)宿主細(xì)胞。該病毒包裝細(xì)胞系為plat E細(xì)胞系，該細(xì)胞系包含gag、pol和env基因，因此轉(zhuǎn)染單一表達(dá)質(zhì)粒就可以包裝出逆轉(zhuǎn)錄病毒，但是該病毒具有很強(qiáng)的針對(duì)性。（圖片來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)）

2.腺病毒

原理：先和細(xì)胞表面的受體結(jié)合，繼而在αv整合素介導(dǎo)下被細(xì)胞內(nèi)吞
主要應(yīng)用：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，特定宿主細(xì)胞
特點(diǎn)：可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，需考慮安全因素。如下圖所示：
腺病毒表達(dá)系統(tǒng)：一種很常用的哺乳動(dòng)物病毒表達(dá)系統(tǒng)；但與慢病毒不同的是，腺病毒基因組及其攜帶的外源基因不會(huì)整合入宿主細(xì)胞的基因組中，而是游離于宿主基因組外獨(dú)立表達(dá)，因此可實(shí)現(xiàn)目的基因瞬時(shí)、高豐度的表達(dá)，同時(shí)還避免了因整合而引發(fā)的潛在的基因突變和隨機(jī)效應(yīng)，安全性和可控性高。（圖片來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)）

物理轉(zhuǎn)染法

1.基因槍粒子轟擊法

原理：將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀，再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細(xì)胞，DNA在胞內(nèi)逐步釋放，表達(dá)。
主要應(yīng)用：瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染
特點(diǎn)：可用于人的表皮細(xì)胞，纖維原細(xì)胞，淋巴細(xì)胞系以及原代細(xì)胞。對(duì)應(yīng)的結(jié)果如下圖所示：
HEK 293細(xì)胞術(shù)后即刻激光共聚焦掃描顯微照片
用Cy3標(biāo)記的siRNA包裹的直徑為1.0μm的金粒子在100psi的氦氣壓力下進(jìn)行轟擊。Cy3標(biāo)記siRNA上樣：2μg/mg金粒子，a）透射光圖像，b）共焦熒光圖像，c）合并圖像。白色箭頭顯示金顆粒。紅色區(qū)域代表Cy3標(biāo)記siRNA的分布。（圖片來(lái)源于Masaki Uchida，Transfection by particle bombardment: Delivery of plasmid DNA into mammalian cells using gene gun .Biochimica et Biophysica Acta 1790 (2009) 754–764）。

2. 顯微注射法

原理：用顯微操作將DNA直接注入靶細(xì)胞核。
主要應(yīng)用：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
特點(diǎn)：轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)有限，多用于工程改造或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的胚胎細(xì)胞。下面是報(bào)道的一篇注射法轉(zhuǎn)染的結(jié)構(gòu)圖：
eGFP和mCherry質(zhì)粒注射
（a）以1:1的比例注射eGFP和mCherry質(zhì)?；旌衔锏腍FF細(xì)胞。（b）用eGFP和mCherry質(zhì)粒的混合物以9:1的比例注射HFF細(xì)胞。（來(lái)源于文獻(xiàn)：Chow YT，Single Cell Transfection through Precise Microinjection with Quantitatively Controlled Injection Volumes.Sci Rep. 2016 Apr 12;6:24127. doi: 10.1038/srep24127.）

3. 電穿孔法

原理：將細(xì)胞短暫暴露于電場(chǎng)中，高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位暫時(shí)穿孔，DNA通過(guò)膜上形成的小孔可以吸收外來(lái)的遺傳物質(zhì)，此方法也適用于傳遞蛋白質(zhì)。
主要應(yīng)用：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，所有細(xì)胞
特點(diǎn)：適用性廣，除了質(zhì)粒外，還可轉(zhuǎn)染大的基因組（>65kb）但細(xì)胞致死率高，DNA和細(xì)胞用量大，需根據(jù)不同細(xì)胞類(lèi)型優(yōu)化電穿孔實(shí)驗(yàn)條件，拷貝數(shù)較少（1-20）。（詳細(xì)的信息可以參考文獻(xiàn)Potter, H., & Heller, R. (2018). Transfection by electroporation.Current Protocols in Molecular Biology, 121, 9.3.1–9.3.13. doi:10.1002/cpmb.48）。

理想細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性小等優(yōu)點(diǎn)。病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，是目前最高轉(zhuǎn)染效率的方法，同時(shí)具有細(xì)胞毒性很低的優(yōu)勢(shì)。但是，病毒轉(zhuǎn)染方法的準(zhǔn)備程序復(fù)雜，常常對(duì)細(xì)胞類(lèi)型有很強(qiáng)的選擇性，在一般實(shí)驗(yàn)室中很難普及。其它物理和化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，則各有其特點(diǎn)。需要指出的一點(diǎn)，無(wú)論采用哪種轉(zhuǎn)染技術(shù)，要獲得*的轉(zhuǎn)染結(jié)果，可能都需要對(duì)轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化。影響轉(zhuǎn)染效率的因素很多，從細(xì)胞類(lèi)型、細(xì)胞培養(yǎng)條件和細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，到轉(zhuǎn)染方法的操作細(xì)節(jié)，都需要考慮。目前實(shí)驗(yàn)室可行的最主要的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作步驟

1. 準(zhǔn)備細(xì)胞（24 孔板為例）：
a) 貼壁細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前18~24小時(shí)，用500 µl 不含抗生素的培養(yǎng)基接種0.5~2E+5 個(gè)細(xì)胞于24孔板中，并將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度達(dá)到70~90%為理想狀態(tài)（具體密度視細(xì)胞的不同可進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整）。
b) 懸浮細(xì)胞：在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前，用500 µl不含抗生素的培養(yǎng)基接種4~8E+5個(gè)細(xì)胞即可。
2. 準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染工作液：
a) 將 0.8~1 µg質(zhì)粒DNA溶于50 µl細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫靜置5 min；
b) 將 2~3 µl 的轉(zhuǎn)染試劑溶于50 µl細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫靜置 5 min；
c) 將上步含有轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基加入含有質(zhì)粒DNA的培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫靜置 20 min；
3. 將上述轉(zhuǎn)染混合液，逐滴滴入接種好的細(xì)胞中，輕輕混勻后置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；
4. 4~8 小時(shí)后，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；
5. 轉(zhuǎn)染24~48小時(shí)后，觀察或收取細(xì)胞。如果篩選穩(wěn)定細(xì)胞株，則在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后將細(xì)胞按1:10或更高的比例接種到新鮮培養(yǎng)基中，第二天加入選擇培養(yǎng)基篩選。

參考文獻(xiàn)

Gulick T .Transfection using DEAE-dextran. Curr Protoc Cell Biol. 2003 Aug;Chapter 20:Unit 20.4. doi: 10.1002/0471143030.cb2004s19.
Masaki Uchida，Transfection by particle bombardment: Delivery of plasmid DNA into mammalian cells using gene gun .Biochimica et Biophysica Acta 1790 (2009) 754–764
Chow YT，Single Cell Transfection through Precise Microinjection with Quantitatively Controlled Injection Volumes.Sci Rep. 2016 Apr 12;6:24127. doi: 10.1038/srep24127.
Potter, H., & Heller, R. (2018). Transfection by electroporation.Current Protocols in Molecular Biology, 121, 9.3.1–9.3.13. doi:10.1002/cpmb.48

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